CRISPRによる編集と細胞表現型をリンク
CRISPR編集と遺伝子発現表現型をシングルセル分解能で直接関連付け
さらに理解を深める
シングルセルの全トランスクリプトームまたはターゲット遺伝子発現により、細胞のフィットネス（生存・増殖）を超えた包括的な理解を取得
CRISPRスクリーニングの規模を拡大
数万の細胞に含まれる数百の遺伝子摂動の影響を解析
結果までの時間を短縮
細胞生存率アッセイに要する長い培養時間と比較し、遺伝子発現の結果を得るまでの時間を短縮
シングルセルの分解能
疾患経路と摂動の影響を細胞ごとに大規模なスケールで検証
合理化されたデータ解析
摂動によって生じた遺伝子発現プロファイルを使いやすいソフトウェアを使って解析
さらなる可能性を探る
機能ゲノミクスの拡張性
分化と発生の原動力を解明
疾患生物学の機構的な理解
ゲノム全体にわたっての疾患への遺伝的寄与を明らかに
実績のある結果
論文
Combinatorial single-cell CRISPR screens by direct guide RNA capture and targeted sequencing
Combinatorial single-cell CRISPR screens by direct guide RNA capture and targeted sequencing
Nature Biotechnology. 2020, Replogle JM, et al.
Nature Biotechnology. 2020, Replogle JM, et al.
High-resolution characterization of gene function using single-cell CRISPR tiling screen
High-resolution characterization of gene function using single-cell CRISPR tiling screen
Nat Commun. 2021, Yang L, et al.
Nat Commun. 2021, Yang L, et al.
Systematic dissection of transcriptional regulatory networks by genome-scale and single-cell CRISPR screens
Systematic dissection of transcriptional regulatory networks by genome-scale and single-cell CRISPR screens
Sci Adv. 2021, Lopes R et al.
Sci Adv. 2021, Lopes R et al.
リソース
ChromiumシングルセルCRISPRスクリーニングの最新アプリケーションノートや製品資料をご覧ください。
Direct capture of guide RNAs enables scalable and combinatorial single cell CRISPR screens
Direct capture of guide RNAs enables scalable and combinatorial single cell CRISPR screens
Research Snapshot, 10x Genomics
Research Snapshot, 10x Genomics
Discovering mechanisms of cancer immune evasion with multiomic single cell CRISPR screens
Discovering mechanisms of cancer immune evasion with multiomic single cell CRISPR screens
Research Snapshot, 10x Genomics
Research Snapshot, 10x Genomics
Transforming drug discovery with single cell CRISPR screens
Transforming drug discovery with single cell CRISPR screens
Infographic, 10x Genomics
Infographic, 10x Genomics
エンドツーエンドのソリューション
Chromiumシングルセル遺伝子発現試薬
3’ mRNAや、細胞表面タンパク質、CRISPR摂動を介し細胞の多様性を探索できる試薬キット
グローバルな技術・カスタマーサポート
専門サポートチームが電話とメールで対応
ワークフロー
- 1
CRISPRライブラリーの設計
数十個の遺伝子にフォーカスして深く調べる場合から、多くの経路を構成する数百個の遺伝子を幅広くスクリーニングする場合まで、機能を調べたい標的遺伝子を選んで解析できます。無償で利用できるたくさんのCRISPRガイドRNA設計ツールを用いてsgRNAを設計し、10x Genomicsのキャプチャー配列に対応したCRISPRベクターにクローニングします。
リソース - 2
サンプルの調製
細胞に形質導入して刺激を与えます。細胞に感染させ、CRISPRガイドを発現している細胞を選択して刺激を加えます。細胞を回収し、数万個にわたる細胞の解析を開始します。細胞の凝集を最小限とし、高品質のシングルセル懸濁液を得るために、最適な方法にしたがって細胞の洗浄や計数、濃縮を行ってください。
リソース - 3
10xライブラリーの構築
試薬キットとChromium Controller装置を使用して、10xバーコードが付加されたライブラリーを構築します。Chromium Controllerでは、10xバーコードがついたゲルビーズを加えてそれぞれの細胞を分画化します。ナノリットル単位で分画化された液滴内部では、細胞は逆転写によってmRNAとCRISPRガイドの両方からcDNAを作成します。１つの細胞から作成されたcDNAには、共通の10xバーコードが付加されています。
シングルセルCRISPRスクリーニングはターゲット遺伝子発現と同時に使用できますか？
はい。全トランスクリプトームへの摂動の影響を探索したり、ターゲット遺伝子発現によって関心のある経路にフォーカスすることで、スクリーニングのスループットの規模を拡大しつつ同時にシーケンスのコストも削減できます。
リソース - 4
シーケンス
10x バーコードが付加されたライブラリーをは、標準的なNGSショートリードシーケンサー（イルミナ）と互換性があります。数千個の細胞にもわたるそれぞれの細胞から、大量の転写プロファイリングを実施します。
リソース - 5
データ解析
Cell Ranger解析ソフトウェアを使用して、細胞ごとにガイドを自動的に割り当て、ターゲット遺伝子や全トランスクリプトームに対するガイドの摂動効果を直接評価します。
解析パイプラインの出力
QCの情報およびファイルが出力され、Loupe Browser視覚化ソフトウェアやサードパーティのRツールまたはPythonツールでのさらなる解析に使用できます。
リソース - 6
データの視覚化
Loupe Browser視覚化ソフトウェアを使用して、結果をインタラクティブに探索します。ガイドターゲット間で、関心のある遺伝子の発現パターンや摂動の結果生じる表現型を調べ、クラスターとサンプルの間の比較解析を実行します。
バイオインフォマティシャンが必要ですか？
Loupeは誰でも簡単にダウンロードして使用できるクリックベースのソフトウェアです。
リソース
よくあるご質問
10x GenomicsのシングルセルCRISPRスクリーニングは、各細胞内のCRISPR sgRNAと細胞転写産物を捕捉してバーコード付加します。これにより、摂動と表現型の直接的な関連付けをプール化されたガイドライブラリーから実現します。シングルセルから得られるデータは、サンプル内の細胞クラスターや亜集団の分解能が可能です。
CRISPRによるノックアウト、阻害、活性化のいずれについても、10x Genomicsのシングルセル遺伝子発現ソリューションとにおいて実証されています。
**10xの5’ CRISPRスクリーニングアッセイは、既存のCas9ガイドRNAベクターの大半に対応します。**既にCRISPRライブラリーをお持ちか、シングルセルCRISPRスクリーニングを初めて開始する場合は、10xのシングルセル5’ v2アッセイの使用をお勧めします。このアッセイは、大半のガイドライブラリーに対応し、最適化はほとんど、または全く必要ありません。
**10xの3’ CRISPRスクリーニングアッセイの場合、ガイドの捕捉に適した場所でベクターに特定のキャプチャー用配列を挿入する必要があります。**シングルセルCRISPR実験と、Feature Barcodeテクノロジーによる3’シングルセル遺伝子発現に基づく過去の実験のデータとを比較したい場合は、バッチ効果を最小限に抑えるため、引き続きシングルセル3’ v3.1アッセイを使用することをお勧めします。
10xの互換製品パートナーであるSigma-Aldrich®*は、カスタムのレンチウイルスパッケージ型Feature Barcodeガイドライブラリーの設計と製造を行っています。Feature Barcode対応CRISPRガイドベクターはAddgeneでも入手可能であり、Weissman Labによって寄託されたpBA900とpBA904がご利用いただけます。
SigmaAldrich® 10x Genomics カスタム CRISPR レンチウイルス製品
シングルガイド発現CRISPRベクター
デュアルガイド発現CRISPRベクター
*Sigma-AldrichはMerck KGaA, Darmstadt, Germanyおよび関連会社の商標です。その他の商標は各保有者が所有しています。商標について詳細な情報は公的にアクセス可能なリソースで入手できます。
遺伝子編集や機能的ゲノミクスのコアラボは、多くの場合、CRISPRガイドの設計に役立つリソースを有しているか、設計の支援が可能です。Addgeneでは、最適なCRISPR sgRNA設計ツールを選択するためのガイドも提供しています。あるいは、MilliporeSigmaに標的遺伝子のリストを提供すれば、注文したライブラリープール用のガイドを設計してくれます。
